TransIT-X2® DYNAMIC DELIVERY SYSTEM

高效  — — 完-美的廣譜轉染試劑

實用性廣 — — 可以適合用于DNA質粒，siRNA/miRNA以及RNP復合物

科技 — — 非脂質體，陽離子聚合物遞送

Mirus X2轉染系統(tǒng)通過創(chuàng)新的聚合物體系有效地將DNA和RNA從核內體遞送到細胞質中，克服了核酸遞送的關鍵障礙。

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圖1.TransIT-X2® Dynamic Delivery System可在多種細胞類型中實現較高水平的基因表達

TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine®2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific）試劑與DNA 3:1將編碼熒光素酶的質粒DNA轉染到41種不同的細胞類型中。使用標準熒光素酶測定法比較轉染后24小時的熒光素素酶的表達。在優(yōu)化比例下實驗結果比較表明，使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在41種細胞類型中的36種細胞中的熒光素酶表達優(yōu)于或者等于競爭品牌；在17種細胞中TransIT-X2® Dynamic Delivery System是Lipofectamine®2000表達水平的2倍，具體細胞在圖中用?表示。

圖2. 使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System細胞中GFP表達水平較高

TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）將編碼EGFP的質粒DNA轉染到A549、CHO-K1、HepG2、LNCaP、MDCK、PC-12、原代人乳腺上皮細胞（HMEC）和原代正常人真皮成纖維細胞（NHDF）。使用4-8μl TransIT-X2®（MirusBio）遞送2μg DNA。使用Zeiss Axiovert S100在轉染后48小時拍照（32X）倒置熒光顯微鏡 *代表原代細胞。

圖3.使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System在多個細胞系和原代細胞中的GFP轉染效率較高

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）將編碼EGFP的質粒DNA轉染到A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮細胞（HMEC）和原代正常人真皮成纖維細胞（NHDF）中。使用0.2-0.4μl TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在96孔板中進行轉染，以遞送0.1μg DNA（轉染試劑：DNA的比率2:1、3:1或4:1）。轉染48小時后，用guava® easyCyte™ 5HT流式細胞儀（MilliporeSigma）對三個孔進行分析。 *代表原代細胞。

圖4. 使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System轉染質粒DNA和siRNA

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）將Cy®5標記的編碼核YFP質粒DNA和Cy®3標記的siRNA轉染到HeLa細胞。使用4μL TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在6孔板中用聚-L-賴氨酸（PLL）涂層的蓋玻片進行轉染，以遞送2μg DNA（2:1試劑：DNA比）和25 nM siRNA。使用Alexa Fluor®350 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）對肌動蛋白細胞骨架進行染色。在轉染后24小時使用Nikon A1R共焦顯微鏡拍攝圖像（63X）。圖像：黃色（核YFP）、藍色（Cy®5標記的DNA）、紅色（Cy™3標記的siRNA）、綠色（肌動蛋白細胞骨架）。

圖5. TransIT-X2® Dynamic Delivery System比Lipofectamine®2000具有更高的敲除率

TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine®2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific）用于轉染靶向內源性蛋白GAPDH和aha1的siRNA，或在原代正常人真皮成纖維細胞（NHDF）中遞送非靶向對照。根據說明書，使用4μl TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）或6μl Lipofectamine®2000（Thermo Fisher Scientific）和25nM siRNA在6孔板中轉染細胞。使用qRT-PCR測定GAPDH或aha1mRNA相對于18S rRNA水平的量，然后在轉染后48小時縮放到陰性對照的mRNA水平。誤差條表示孔中的標準偏差。

圖6.使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System有效遞送miRNA 可降低PTK9 mRNA水平

TransIT-X2® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine®2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific）用于轉染帶有Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA前體（Thermo Fisher Scientific）或mirVana™ miRNA模擬物（Thermo Fisher Scientific）的T47D細胞™。miR-1兩者都能降低PTK9 mRNA水平。轉染Pre-miR陰性對照以評估基線mRNA水平。根據每個制造商的方案，使用3μl TransIT-X2®（Mirus Bio）或Lipofectamine®2000（Thermo Fisher Scientific）和50 nM miRNA在12孔板中轉染細胞。使用qRT-PCR測量PTK9 mRNA相對于18S rRNA水平的量，然后在轉染后48小時將其換算為陰性對照的mRNA水平。誤差條表示復孔的標準偏差。 

用于

質粒DNA和gRNA寡核苷酸轉染

Cas9蛋白和gRNA都可以由質粒DNA編碼用于轉染。或者Cas9可以像質粒DNA一樣被轉染，gRNA可以作為RNA寡核苷酸。

這些方法的優(yōu)點包括：

● 低成本-質粒DNA是一種可再生、經濟高效的格式

● 靈活性-Cas9和gRNA質粒適用于穩(wěn)定或瞬時轉染

● 易于使用-gRNA寡核苷酸格式可將Cas9簡單地重新定位到不同的位點

圖7.用Cas9質粒DNA和gRNA寡核苷酸進行高效基因組編輯

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System（24孔板的2µl/孔，Mirus Bio），用0.5µg編碼pDNA的Cas9（Millipore Sigma）和50 nM PPIB靶向兩部分gRNA（Dharmacon/GE Healthcare）共轉染HEK 293T/17、U2OS和NHDF細胞。T7E1錯配檢測法用于測定轉染后48小時的切割效率。

Cas9/gRNA核糖核蛋白（RNP）轉染

純化的Cas9蛋白可與gRNA結合，形成RNP復合物，將其遞送至細胞，用于快速高效的基因組編輯。

基于RNP的基因組編輯的好處

● 高效轉染-將Cas9/gRNA復合物轉染至多種細胞類型，包括難以轉染的細胞，如免疫細胞和干細胞

● 高特異性-預先形成的RNP復合物提供基因組編輯活動的快速脈沖

● 無DNA-無插入突變風險

圖8. TransIT-X2®在RNP轉染方面優(yōu)于其他試劑

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System（1µl/孔，Mirus Bio）或Lipofectamine®CRISPRMAX™ （1.5µl/孔和1µl/孔Lipofectamine®Cas9 Plus™ 試劑，Thermo Fisher）或Lipofectamine®RNAiMAX（1.5µl/孔，Thermo Fisher）或Lipofectamine™3000（1.5µl/孔和1µl/孔P3000™ 試劑，Thermo Fisher）將由靶向2部分gRNA（IDT）的PPIB（親環(huán)蛋白B）和Cas9蛋白（PNA Bio）組成的蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）復合物遞送到（A）HEK 293T/17和（B）U2OS細胞中。根據操作手冊，采用24孔板，用6nM Cas9蛋白（PNA Bio）測試不同水平的gRNA（6nM或12nM）。T7E1錯配檢測法用于測定轉染后48小時的切割效率。

圖9.用Cas9和gRNA核糖核蛋白復合物在IPS細胞中進行基因組編輯

TransIT-X2® Dynamic Delivery System用于在人誘導多能干細胞（iPSC）中轉染Cas9蛋白/gRNA核糖核蛋白（RNP）復合物。T7E1錯配方法用于測定轉染后48小時的切割效率。

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