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Mirus公司最新推出的適用于臨床前研究和早期臨床實(shí)驗(yàn)中大規(guī)模生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒和慢病毒轉(zhuǎn)染試劑TransIT-VirusGEN®SELECT Transfection Reagent面世了，TransIT-VirusGEN®系列轉(zhuǎn)染試劑旨在提高載體DNA轉(zhuǎn)染到懸浮和貼壁HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并增加重組腺相關(guān)病毒和慢病毒的產(chǎn)量。并可提供BSE TSE Statement 和質(zhì)量控制的相關(guān)文件，以簡(jiǎn)化輔助材料的資質(zhì)認(rèn)證過(guò)程，節(jié)省時(shí)間和成本，確保從研發(fā)到大規(guī)模生產(chǎn)的無(wú)縫銜接，成為臨床前研究和早期臨床實(shí)驗(yàn)中大規(guī)模生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒/慢病毒的理想工具。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
高效轉(zhuǎn)染DNA，適用于臨床前研究和早期臨床實(shí)驗(yàn)中重組腺相關(guān)病毒
和慢病毒的大規(guī)模生產(chǎn)；
質(zhì)控嚴(yán)格，包括產(chǎn)品性能、批次重復(fù)性、無(wú)菌性、內(nèi)毒素及支原體含
量測(cè)試；
靈活性好，兼容不同的病毒生產(chǎn)平臺(tái)并且允許重復(fù)過(guò)濾；
無(wú)動(dòng)物源成分，保證全合成制劑成分清晰。
驗(yàn)證實(shí)例：
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| 圖1. TransIT-VirusGEN® Reagent和 VirusGEN® AAV Transfection Kit能產(chǎn)生更高的AAV滴度。 A.在Expi293 Expression Media(Thermo Fisher)中生長(zhǎng)的Expi293F細(xì)胞(Thermo Fisher)使用TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑(1.5:1 reagent-to-DNA ratio (vol:wt), Mirus Bio LLC)，VirusGEN®AAV轉(zhuǎn)染試劑盒(Mirus Bio LLC)，PEIpro (1:1，Polyplus)和FectoVIR®-AAV (1:1, Polyplus)的瞬時(shí) 轉(zhuǎn) 染 來(lái) 產(chǎn) 生 重 組 AAV2。AAV2是 通 過(guò) 轉(zhuǎn) 染 pAAV-hrGFP、pAAV-RC和 pAAV-Helper質(zhì) 粒(1:1:1的DNA比例，每瓶2 μg/ml-2 mg，Agilent Technologies)產(chǎn)生的。1L的2×106細(xì)胞/ml密度在2.8L 的Thomson shake flask中轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)使用化學(xué)裂解收獲AAV2。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞來(lái)測(cè)定功能性滴度，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)使用Guava®easyCyte 5HT流式細(xì)胞儀測(cè)量綠色熒光蛋白的表達(dá)。用少于20% GFP陽(yáng)性細(xì)胞的病毒稀釋液測(cè)量AAV功能滴度。基因組拷貝通過(guò)使用引物和靶向CMV啟動(dòng)子的 探針的ddPCR測(cè) 定 。B. 使 用 AAV2 Titration ELISA Kit(Progen)測(cè)定總組裝衣殼，通過(guò)將基因組拷貝數(shù)除以每種條件下的總組裝衣殼來(lái)確定GC/capsid ratio。誤差線代表duplicate flasks的范圍。 | 圖2. 在不同的懸浮細(xì)胞類型和培養(yǎng)基配方中TransIT-VirusGEN® Reagen和VirusGEN®AAV Transfection Kit在AAV生產(chǎn)中的表現(xiàn)優(yōu)于基于PEI的試劑。(A) Expi293F細(xì)胞(ThermoFisher)或(B)病毒生產(chǎn)細(xì)胞(ThermoFisher)在轉(zhuǎn)染前適應(yīng)或生長(zhǎng)在Expi293培養(yǎng)基 (Thermofisher)、LV-MAX (Thermofisher)、FreeStyle™ F17 (ThermoFisher)或BalanCD HEK293 (Irvine Scientific)培養(yǎng)基。使用TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑(2:1reagent-to-DNA ratio (vol:wt)(體 積 :重 量 )， Mirus Bio LLC)，VirusGEN® AAV Transfection Kit(Mirus Bio LLC)的 AAV生 產(chǎn) 與 PEIpro (1:1reagent-to-DNA ratio(vol:wt)，Polyplus)和PEI MAX (2:1reagent-to-DNA ratio (vol:wt)，Polysciences)進(jìn)行比較。AAV2是通過(guò)轉(zhuǎn)染pAAV-hrGFP、pAAV-RC和pAAV-Helper質(zhì)粒(1:1:1 DNA比例，1.5μg/ml = 3μg/孔，Agilent Technologies)產(chǎn)生的。細(xì)胞以200萬(wàn)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)染。收獲的病毒用于轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)使用Guava® easyCyte™5HT流式細(xì)胞儀測(cè)量綠色熒光蛋白的表達(dá)。用少于20% GFP陽(yáng)性細(xì)胞的病毒稀釋液測(cè)量AAV功能滴度。誤差線代表重復(fù)孔的范圍。 |
 | 圖3. TransIT-VirusGEN® Reagent和VirusGEN® LV Transfection Kit在多種慢病毒包裝系統(tǒng)方面優(yōu)于基于PEI的試劑。使用TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑 +/-將 VirusGEN® LV Enhancer與 PEIpro (2:12:1 reagent-to-DNA ratio，Polyplus)和PEI MAX (4:12:1 reagent-to-DNA ratio，Polysciences)進(jìn)行比較。慢病毒是通過(guò)用兩種不同的LV載體混合物(1μg/ml，2μg/ml)轉(zhuǎn)染在Expi293表達(dá)培養(yǎng)基(Thermo Fisher)中生長(zhǎng)的Expi293細(xì)胞而產(chǎn)生的，包括:(A)第三代載體pALD-LentiEGFP-A轉(zhuǎn)移載體和pALD-VSV-G-A、pALDRev-A、pALD-GagPol-A包 裝 載 體 (3:0.5:0.5:2 DNA比 例 ， Aldevron)或(B)第 三 代 載 體 pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP™ transfer vector(MilliporeSigma) 和 ViraSafe™ Pantropic Packaging mix (pRSV-Rev,pCMV-VSV-G, pCgpV, CellBio Labs) 以 3:0.5:0.5:2 DNA比例轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，將VirusGEN® LV Enhancer加入到TransIT-VirusGEN®中。含病毒的上清液用于轉(zhuǎn)導(dǎo)293T/17細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)使用Guava®easyCyte™ 5HT流式細(xì)胞儀測(cè)量綠色熒光蛋白的表達(dá)。慢病毒功能滴度是從含有少于20%GFP陽(yáng)性細(xì)胞的病毒稀釋液中測(cè)定的。誤差線代表重復(fù)孔的范圍。 |
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| 圖4. TransIT-VirusGEN® Reagent和VirusGEN® LV Transfection Kit可與多種細(xì)胞系和培養(yǎng)基配方兼容，用于在懸浮293細(xì)胞中生產(chǎn)慢病毒。在LV-MAX生產(chǎn)培養(yǎng)基(ThermoFisher)中生長(zhǎng)的病毒生產(chǎn)細(xì)胞(293-VP)、在Expi293表達(dá)培養(yǎng)基(ThermoFisher)中生長(zhǎng)的Expi293細(xì)胞或在FreeStyle™F17 (ThermoFisher)中生長(zhǎng)的FreeStyle™ 293-F細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前以4×10^6細(xì)胞/ml接種(2ml/未處理的6孔 板 )。使用 TransIT-VirusGEN 轉(zhuǎn) 染 試 劑 +/- VirusGEN LV Enhancer(Mirus Bio，3:1 reagent-to-DNA ratio(wt:vol))生產(chǎn)慢病毒。通過(guò)以3:0.5:0.5:2的DNA比例(Aldevron，25μg/瓶(1μg/ml最終濃度 ))轉(zhuǎn)染第三代載體 ALD-LentiEGFP-A轉(zhuǎn)移載體和 pALD-VSV-G-A、pALD-RevA、pALD-GagPol-A包裝載體來(lái)生產(chǎn)慢病毒。轉(zhuǎn)染后18小時(shí)加入 VirusGEN® LV Enhancer。在轉(zhuǎn)導(dǎo) 293T/17細(xì)胞后，測(cè)量含病毒上清液的功能滴度，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)，使用Guava easyCyte™5HT流式細(xì)胞儀測(cè)量綠色熒光蛋白的表達(dá)。慢病毒功能滴度是從含有少于 20% GFP陽(yáng)性細(xì)胞的病毒稀釋液中測(cè)定的。誤差條代表三個(gè)孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 | 圖5. TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑可以多次過(guò)濾且對(duì)試劑性能沒(méi)有影響。 (A)使用在FreeStyle™ F17培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的懸浮FreeStyle™ 293-F細(xì)胞生產(chǎn)慢病毒，并用第三代載體pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP轉(zhuǎn)移載體(Sigma)和ViraSafe™ Pantropic Packaging mix (pRSV-Rev, pCMV-VSV-G, pCgpV, Cell Bio Labs)以 3:0.5:0.5:2的DNA比例轉(zhuǎn)染，總質(zhì)粒1ug/ml，使用TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑(3:1，體積:重量)，TransIT-VirusGEN® Transfection Reagent (3:1, vol:wt)通 過(guò) 0.22 um polyethersulfone(PES)過(guò)濾裝置(Millipore Sigma)過(guò)濾指-定次數(shù)。使用通過(guò)含病毒的上清液轉(zhuǎn)導(dǎo) ® 293T/17細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)使用Guava easyCyte™ 5HT流式細(xì)胞儀測(cè)量綠色熒光蛋白的表達(dá)。 (B)AAV2是通過(guò)在FreeStyle™ F17培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的懸浮FreeStyle™ 293-F細(xì)胞產(chǎn)生的，使用TransIT-VirusGEN® Transfection Reagent (2:1, vol:wt)轉(zhuǎn) 染 pAAVhrGFP、pAAV-RC和 pAAV-Helper質(zhì) 粒 (1:1:1DNA ratio，1.5u g/ml，AgilentT ® echnologies)。收獲的病毒用于轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)使用Guava easyCyte™ 5HT Flow Cytometer.流式細(xì)胞儀測(cè)量綠色熒光蛋白的表達(dá)。對(duì)于慢病毒和AAV病毒，功能滴度都是從含有少于20% GFP陽(yáng)性細(xì)胞的病毒稀釋液中測(cè)定的。誤差條代表三個(gè)孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 |
驗(yàn)證實(shí)例
| 用途 | 科研 | 臨床前和早期臨床實(shí)驗(yàn) | 后期臨床試驗(yàn)和商業(yè)生產(chǎn) | ||
| 名稱 | TransIT-VirusGEN®
| TransIT-VirusGEN® SELECT
| TransIT-VirusGEN® GMP
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| 成分 | 相同的TransIT-VirusGEN® 試劑配方可隨時(shí)使用，化學(xué)成分明確，不含動(dòng)物源，含有77.5%乙醇 | ||||
是否提供 LV 和 AAV Enhancer Kits | 提供 | 即將推出 | 提供 | ||
| 貨號(hào) | 名稱 | 貨號(hào) | 名稱 | ||
| MIR 6750 | VirusGEN® AAV Transfection Kit | MIR 6815-GMP | VirusGEN® GMP AAV Transfection Kit | ||
| MIR 6760 | VirusGEN® LV Transfection Kit | MIR 6825-GMP | VirusGEN® GMP LV Transfection Kit | ||
| 質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn) | Functional AAV titer assay | Functional AAV titer assay Formulation Identity Appearance Sterility per USP<71> Bacterial endotoxin per USP<85> Mycoplasma per USP<63> | Validated Formulation Identity Assay Appearance Sterility per USP<71> Bacterial endotoxin per USP<85> Mycoplasma per USP<63> | ||
貨號(hào)與規(guī)格 | MIR 6703 MIR 6704 MIR 6700 MIR 6705 MIR 6706 MIR 6720 | 0.3 ml vial 0.75 ml vial 1.5 ml vial 5 x 1.5 ml vials 10 x 1.5 ml vials 30ml | MIR 6730 MIR 6735 30ml bottle (for 10 L of cell culture) 150ml bottle (for 50 L of cell culture) | MIR 6845-GMP | 150 ml bottle (for 50 L of cell culture) |
| 提供文件材料 | Certificate of Analysis Certificate of Origin | Certificate of Analysis Certificate of Origin TSE/BSE Statement | Certificate of Analysis Certificate of Origin with TSE/BSE Statement DMF Available in 2022 with Quality Agreement | ||
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